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高效液相色谱在药物分析方面的研究进展

发表日期:2020-01-25 23:09:59   编辑:李天恩

  摘要:高效液相色谱法已大量的运用在药物制剂的分析和定性方面,随着色谱法相关理论、技术和仪器的快速发展,液相色谱已经成为最有效的分离和分析方法。近年来,高效液相色谱法在生物样品,中药材等复杂体系的成分分离分析中的作用越来越重要。通过查阅积累大量文献,本文将主要介绍高效液相色谱在药物分析方面的研究和进展。

  关键词:高效液相色谱法 药物分析 研究与进展

  正文:高效液相色谱(High Performance Liguid Chromatography,HPLC)是现代分离测定的重要手段。鉴于其简便快速、灵敏准确,目前,在医药卫生、食品、环保等各个领域已得到了广泛的应用[1-3]。世界各国已将高效液相色谱法作为检测药物的标准收载于药典。HPLC是在经典液相色谱法的基础上,引入了气相色谱法的理论和实验技术,以高压输送流动相,采用高效固定相及高灵敏度检测器,发展而成的现代液相色谱分析方法。它具有高效的分离效率,良好的选择性,快速的检测速度以及检测灵敏度高,操作自动化和应用范围广的特点。目前,高效液相色谱法已被广泛用于生命科学和医药上有重大意义的大分子物质,例如蛋白质,多糖类,高聚物及药物等的分离鉴定和分析。

  高效液相色谱法

  1.1高效液相色谱法的历史及演变

  本世纪初,俄国植物化学家茨维特第一次提出“色谱”(Chromotography)、“色谱图”(Chromatogram)和“色谱法”(Chromatographic method)的概念。30年代以后,相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。到了50年代英国学者Martin和Synge 基于他们在分配色谱上的研究工作,提出了关于气-液分配色谱的比较完整的理论和方法,把色谱技术向前推进了一大步。60年代中后期,气相色谱理论和实践的发展,以及机械设计、光学理论、电子等技术上的进步,液相色谱又开始活跃。到60年代末期在液相色谱的基础上运用高压泵和化学键合固定相于是就出现了高效液相色谱。70年代相继出现了毛细管气相色谱和制备色谱。80年代随着技术的进步,有了毛细管电泳色谱和色谱联用技术,大大的提高了在分析制备方面的应用.1990年以后,生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展,高效液相色谱法技术面临着更多、更新的分离、纯化、制备的课题,如人类基因组计划和蛋白质组学用HPLC作预分离等。同时光学异构体色谱和逆流色谱相继出现并得到大量的应用。

  1.2 高效液相色谱法的主要类型及优点

  近年来高效液相色谱法的发展非常迅猛,在经典液相色谱各类方法的基础上,又有了很多新的方法不断出现和完善。按照固定性的凝聚状态包括液液色谱法和液固色谱法两大类。按照分离机制则包括分配色谱法,吸附色谱法,离子交换色谱法和分子排阻色谱法。此外还有很多与分离机制有关的色谱类型,例如亲和色谱法,手性色谱法,胶束色谱法,电色谱法,生物色谱法等。比起经典液相色谱法,高效液相色谱法的最大优点在于:

  1)高压:作为流动相的液体流过色谱柱时遇到的阻力较大,为了快速通过色谱柱,必须施加高压来携带液体。

  2)高速:流动相在色谱柱内的流速比经典色谱快得多,一般可达1~10ml/min,同时所需要的分析时间比经典液相色谱法少得多,一般少于 1h 。

  3)高效:近年来已经研究出许多新型固定相从而使色谱柱的分离效率大大提高。

  4)高灵敏度:高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10~11g。另外用样量小一般几个微升。

  5)适应范围宽:与高效液相色谱(HPLC)相比,气相色谱具有分离性好,灵敏度高,分析快速,操作方便的优点,但受技术条件的限制。 具有太高沸点或差热稳定性的物质难以通过气相色谱法分析。 高效液相色谱(HPLC)仅需要样品能够形成溶液而不需要气化,因此不会受到样品挥发性的影响。 对于高沸点,热稳定性差,这些物质的相对分子量超过400的有机物占总有机物的75%左右,原则上可以应用于高效液相色谱法分离和 分析。 根据统计,约20%的已知化合物可以通过气相色谱法分析,约70-80%可以通过液相色谱法分析。

  2. 高效液相色谱仪

  高效液相色谱的主要组成部件有:储液罐,高压输液泵,进样器,色谱柱,检测器,记录仪和数据处理设备。 基本工作流程是:储罐的流动相通过高压泵进入系统,样品溶液通过进样器进入流动相,流动相和样品溶液进入柱中,样品溶液中的两个组分在固定相和流动相中的相对分布系数彼此不同在两相之间的相对运动的过程中,吸附-解吸的过程重复多次,并且将组分分离成单一组分通过色谱柱流出,进入检测器,将样品浓度转化为电信号送到记录仪,数据以图谱的形式打印出来。

  2.1 储液器

  储液器可用玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮等具有耐腐蚀特点的材料制备。容积一般为0.5 L~2.0 L。对凝胶色谱仪、制备型仪器,其容积应大些。储液器放置位置要高于泵体,以便保持一定的输液静压差。在使用期间应保证储液器密封以防止溶剂的蒸发,从而引起流动相组成的变化并防止脱氧流动相中的氧和二氧化碳的再溶解。

  2.2 高压输液泵

  高压输液泵一般可分为恒压泵和恒流泵。泵体材料能耐化学腐蚀,能在高压下持续工作并且输出流量范围宽,流量稳定,具有高度重复性。

  2.3 色谱柱

  色谱柱包括柱头,柱体和过滤网。柱体材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内壁光滑的聚合材料的其它金属。一般色谱为5cm~30cm,内径为4mm~5mm,凝胶色谱柱内径为3mm~12mm,制备色谱柱内径可达25mm以上。

  2.4 检测器

  高效液相色谱法中的检测器主要用来监视经色谱柱分离后的组分随淋洗液流出的浓度变化,所描记的图形用于进行定性和定量分析,因此,要求检测器应该具有高的灵敏度、好的重复性、宽的线性范围、广的适应范围以及对流量和温度的变化不敏感等特性。常用的检测器包括紫外—可见光检测器(UVD)、示差折光指数检测器(RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。在实际运用中根据样品的特性选择合适的检测器。

  3. 高效液相色谱在药物分析中的应用

  3.1 在药物鉴别中的应用

  中药片的加工和中成药的生产原料来自中药材,其品种的真伪、质量的好坏直接影响到临床安全性和有效性。中药的鉴别是至关重要的一步。通过监督检查发现,有许多中草药假冒商品,混淆发生率大,假冒商品易混淆和正宗草本看起来相似,但不同来源,性状和效果差异很大,价格差异往往很大。根据对象的不同,常不能仅从形态上鉴别。在高效液相色谱法中,可利用峰加高的方法进行定性定量分析,定量分析包括面积归一法,外标法,内标法。另外还可以依据药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系,不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同,是定性分析的重要参数,两者都可以用于药物的鉴别。如中国药典收载的利福平的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致;中国药典收载的欣弗的鉴别项下规定:在克林霉素磷酸酯含量测定项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与克林霉素磷酸酯对照品主峰的保留时间一致[4]。

  3.2 在药物杂质检查中的应用

  HPLC分离效能高,灵敏,在药物的杂质检查中应用广泛,主要用于药物中有关物质的检查。若杂质是已知的,又有杂质的对照品,可用杂质对照品做对照进行检查;若杂质是未知的,可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查[5]。“有关物质”是指药物中存在的合成原料、中间体、副产物、降解产物等物质,这些物质的结构和性质与药物相似,含量低,只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。若杂质是已知的,又有杂质的对照品,可用杂质对照品做空白对照进行检查。若杂质是未知的,可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查。例如倪冲、廖玉山等利用高效液相色谱法(HPLC)测定曲尼司特滴眼液中曲尼司特及其有关物质的含量[6]。李旭仁、李霞等采用高效液相色谱法测定甲磺酸培氟沙星片含量及有关物质。刘向红、冷晓燕等采用高效液相色谱法(HPLC)测定苄达赖氨酸滴眼液的有关物质[7]。金鸽、李雪等采用高效液相色谱法(HPLC)测定苄达赖氨酸滴眼液的含量和有关物质[8]。左雄军.等[9]用0.02mol/L的三羟甲基胺基甲烷(用磷酸调p H值至7)和甲醇(含2%乙酸和0.25%庚烷磺酸钠)作流动相进行梯度洗脱,建立了脂性油膏药物中黄芩甙含量的反相高效液相色谱分析方法,本法分析速度快,重现性好,黄芩甙的平均回收率为103.7%。张晓青.等[10]采用反相离子对高效液相色谱法研究了唑来膦酸及其有关化合物的色谱分析与分离方法。优化的分离条件:以Hypersil C8柱为固定相,以甲醇5mmol/L。磷酸二氢钠缓冲液(含6mmol/L。四丁基溴化铵溶液,用氢氧化钠溶液调节p H至7)(体积比为20:80)为流动相,等度洗脱,流速为1.0ml/rain,紫外检测波长为220rim,柱温为室温。在该色谱条件下,唑来膦酸与有关化合物(包括其合成过程中残余的原料咪唑乙酸和其他氧化分解产物)的分离良好,与保留时间最接近的杂质峰的分离度于2.5。该方法不需进行复杂的样品处理,简单快速,适用于唑来膦酸的常规分析。

  4 高效液相色谱法及其联用技术在药物分析中的应用展望

  高效液相的发展趋势是联用技术的发展。目前人们所面临的问题,往往很难再用单相分析分离方法解决。而常需用色谱、质谱、光谱、核磁等多种方法综合加以解决。随着计算机技术的发展,多种联用形式已成为现实,如Gc-MC、Ms-LC等。其中小口径毛细管液相色谱和质谱的联用基本上克服了本底的干扰,所以在医药分析上应用十分广泛。液相色谱与紫外光谱的联合定性是二维定性,其优点不言而喻,所以也有很大潜力。近年来, HPLC 仪的组成部件: 输液泵、色谱柱、检测器都有新的发展, 尤其是检测器方面的发展,如二极管阵列检测器已普遍应用, 蒸发光散射检测器对无近紫外吸收的药物, 提供了一种有效的高灵敏度的方法。例如高效液相色谱和质谱联用集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体,因此被广泛应用于药物分析、生物大分子分析、农药,兽药残留量分析、兴奋剂和毒品检测。在药物杂质检测中, HPLC-MS 测定和HPLC-核磁共振(NMR) 测定都是简便、快速的方法,但HPLC-NMR 联用技术中NMR 测定不受HPLC 分离过程中使用的缓冲盐溶液的限制, 并可以提供大量的结构信息。例如杨春.等利用高效液相色谱与核磁共振仪联用技术在耐哌地尔杂质检测中的应用根据HNRM, H2HCOSY谱完成了主要杂质12萘环2丙三醇结构鉴定。HPLC-NMR 是解决合成药物中杂质结构确证的简便、快速方法[11]。HPLC-MS 联用在体内药物代谢研究、临床药物检测和生物大分子测定有着广泛的用途。微柱液相色谱法的研究也十分活跃, 由于分析所需的样品量及流动相的消耗大大下降, 检测的灵敏度又大大提高,使HPLC分析更加灵敏准确、简便快速。特别是联用技术的发展, 使之在生物工程和生命科学领域的应用更具重要意义。

  综上所述, 高效液相色谱法在药物分析中的应用是广泛的。所有应用均表明, 在药物分析中高效液相色谱法是一种高效能、高灵敏度、高准确度及操作简便的分析办法。随着新型检测方法的问世及与计算机的联用,高效液相色谱法将在药物分析中发挥更大的作用。

  参考文献:

  [1] The United states pharmacopeia convention,The United states pharmacopeia[S]. Appendix.1774 -1777

  [2] British pharmacopoeia commission,British phavmacopia[S]. Appendix,2002 . 140 -144

  [3]国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2000.附录. 32 -34

  [4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2000,二部.

  [5]Liu Q, Peng Z, Liang XY. Progress in the detection of selenium-containing trace proteins.Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 2009.29 (2):530-535.

  [6] 倪冲,缪玉山,陈国明, 王晨霞. 高效液相色谱法测定曲尼司特滴眼液中曲尼司特及其有关物质的含量[J] . 东南大学学报:医学版 ,2008, 27( 5) : 365-367.

  [7] 李绪伦,李霞,曾杰,刘映倩.HPLC法测定甲磺酸培氟沙星片含量及有关物质[J] .儿科药学杂志, 2009,15(3):49-50.

  [8] 刘向红、冷晓燕,许靖.高效液相色谱法测定苄达赖氨酸滴眼液的有关物质[J] .石油化工应用,2008,27(2):65-67.

  [9]左雄军,徐友志,徐秉坤.脂性油膏药物中黄芩甙含量的高效液相色谱分析[J],分析测试技术与仪器,1994.12(4):54-56。

  [10]张晓青,蒋晔,徐智儒.唑来膦酸及其有关化合物的反相离子对高效液相色谱分离[J],色谱,2004,22(4):428-430.

  [11]杨春,司伊康,贺文义. 高效液相色谱-核磁共振仪联用技术在耐哌地尔杂质检测中的应用[J], Chinese Journal of Analytical Chemistry. 2001. 25(7):796-798.

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