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朝医麻黄定喘汤对哮喘小鼠气道炎性反应的影响

发表日期:2020-01-29 23:37:34   编辑:杨今实

  [摘要]目的:探讨朝医麻黄定喘汤对支气管哮喘小鼠气道炎性反应的影响及血管内皮生长因子(VEGF)表达的强弱。方法:清洁级BABL/c雄性小鼠40只,随机分成5 组:正常对照组,哮喘模型组,麻黄定喘汤低、高剂量组,地塞米松治疗组,每组8只。用卵清蛋白(OVA)造模,采用ELISA法检测肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞分类及炎性细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-13(IL-13)、干扰素-γ(IFN-γ)含量;Western blot检测肺组织中VEGF表达的变化;左肺组织切片后,进行苏木精-伊红(HE)染色、PAS染色、MASSON三色染色及VEGF免疫组织化学染色。结果:与正常对照组比较,哮喘模型组小鼠BALF中炎性细胞计数增多,IL-4、IL-5、IL-13水平增高(P<0.01),IFN-γ水平降低(P<0.01);肺组织VEGF表达水平升高(P<0.01)。与哮喘模型组比较,朝医麻黄定喘汤低、高剂量组和地塞米松治疗组小鼠BALF中炎性细胞计数、IL-4、IL-5、IL-13水平和肺组织VEGF表达水平均明显低,IFN-γ水平明显上升(P<0.05,P<0.01)。结论:朝医麻黄定喘汤可使机体内微血管的通透性增加,其机制可能与VEGF的增加血管的通透性、促进血管生成有关。

  [关键词]朝医;麻黄定喘汤;哮喘;VEGF

  [基金资助]国家自然科学基金项目(No.81560810),吉林省卫生计生科研计划项目(No.2014z093)

  支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞、支气管上皮细胞等多种细胞及细胞组分参与的炎症性疾病[1]。其发病率受环境因素[2] 、体质因素等影响,近几年呈上升趋势。

  血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)做为血小板衍生生长因子(PDGF)家族成员之一,在支气管炎症和支气管重塑过程中起着重要作用[3]。VEGF是已知的最强的血管通透剂,也是最强的具有促进血管生成、增强血管壁通透性的细胞因子。

  麻黄定喘汤出自李济马先生的《东医寿世保元》,对哮喘发作期治疗效果明显。课题组本次实验进一步阐明朝医麻黄定喘汤对小鼠哮喘模型的影响,以及对VEGF表达的影响。现报告如下。

  材料

  1. 动物 SPF级6-8周龄雄性BALB/c小鼠40只, 体质量(18±5)g,由延边大学医学部实验动物中心提供,合格证号:SCXK(吉)2011-0007。

  2. 药品与试剂 卵清蛋白(OVA)(批号:A5503,美国Sigma)、氢氧化铝粉(批号: A1577,美国Sigma)、细胞因子白细胞介素-4 (Interleukin-4,IL-4)(批号:AAM36)、白细胞介素-5(Interleukin-5,IL-5)(批号:SC-7887)、白细胞介素-13(Interleukin-13,IL-13)(批号:NF-413-NA)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)(批号:RAB-0225)检测试剂盒、VEGF检测试剂盒均购自长春百奥生物科技有限公司。麻黄定喘汤由麻黄、杏仁、黄芩、莱菔子、桑白皮、桔梗、麦冬、款冬花、白果、蒲公英组成,延边保健药房购买。地塞米松注射液:每1mL:5mg,浙江仙居制药股份有限公司生产(生产批号:080503)。

  3. 仪器 402型超声雾化器(上海四菱医疗器械 厂,ME-U29型超声雾化器);酶联免疫检测仪(RT- 2100C,美国);E-C电泳仪及电泳槽(美国Apparatus Corporation)。Western blot转膜仪(BioRad公司);旋转蒸发仪(EYELA,Tokyo Rikakikai)。

  方法

  1. 药物的制备 麻黄定喘汤提取物由延边大学药学院提供。上述朝药制备参考文献[4-5]粉碎成粗粉后采用75%乙醇为提取溶媒,8倍乙醇,经热回流提取3次,每次120min,合并提取液,回收乙醇得干燥粉末,取400mg朝药提取物溶解于20mL 0.9%氯化钠溶液配制成20mg/mL的供试液。

  2. 小鼠哮喘模型的建立和分组 分组、造模及给药参考文献[6]方法,并略加改进制备小鼠哮喘发作期模型。将清洁级BALB/c雄性小鼠随机分为5组:正常对照组,哮喘模型组,麻黄定喘汤低、高剂量组,地塞米松治疗组,每组8只。各组药物分别于第17天开始每日灌胃给药1次,共给药8周。正常对照组和哮喘模型组灌胃0.9%氯化钠溶液0.4mL;麻黄定喘汤低、高剂 量组 ,分别以 150、300 m g / k g 麻黄定喘汤供试液 ,灌胃给药每只各0.4mL;地塞米松治疗组以0.5mg/kg、 0.1mL/只,0.01mL(g.d)灌胃,每日1次。末次给药24h后处死,测定相关指标。

  3. 取材 末次激发24h后处死小鼠,即刻打开胸腔,暴露气管,行气管插管,去肺泡灌洗液。用2mL 0.9%氯 化钠溶液分3次于气管插管处注入后回收。肺泡灌洗液(BALF)计数以双盲法在高倍显微镜下计数除上皮和红细胞以外的细胞 。切取左肺近肺门组织,4%多聚甲醛固定4-6h,转入70%乙醇,常规石腊包埋切片,用于HE、PAS和MASSON染色检测。取右肺下叶,放入液氮中速冻,-80°C保存。

  4. BALF中细胞因子含量的检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行测定,具体操作按试剂盒说明书检测 B ALF中IL-4、IL-5、IL-13含量,检测结果以ng/L表示。

  5. Western blot检测 取液氮中保存的小鼠右肺组织标本,测定蛋白浓度,进行后续Western blot操作。用Bradford蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度(按试剂盒说明的方法进行)。将获得各组动物肺组织蛋白浓度进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,图象分析系统对 Western blot目的条带进行分析。将小鼠肺组织匀浆提取核蛋白后用兔抗vegf(稀释浓度为 1∶1 000)抗体进行Western blot检测。

  6. 肺组织病理学观察 取右肺部分组织行冰冻切片,常规固定、脱水、HE染色,观察气道、肺组织病理学改变。

  7. 免疫组化流程及半定量测定 使用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin perosidase,SP法)进行检测。

  8. 统计学方法数据x±s表示,经SAS13.0统计软件进行分析。组间差异的显著性采用方差分析的q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

  结果

  1. 各组小鼠BALF中的炎性细胞总数、分类及 计数 见表1。与正常对照组比较,哮喘模型组小鼠BALF中 炎性细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞计数明显升高(P<0.01);与哮喘模型组比较,鹿茸大补汤低、高剂量组和地塞米松治疗组小鼠BALF中炎性细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞计数较哮喘组明显降低(P<0.05, P<0.01),各组巨噬细胞比较无明显差异。

  2. BALF中炎性细胞因子IL-4、IL-5,IL-13和 IFN-γ的含量变化见表2。与正常对照组比较,哮喘模型组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平升高而 IFN-γ水平降低(P<0.01);与哮喘模型组比较,麻黄定喘汤低、高剂量组和地塞米松治疗组小鼠BALF中细胞因子IL-4,IL-5,IL-13水平降低而IFN-γ水平升高,差异显著(P<0.05,P<0.01)。

  3. 肺组织VEGF蛋白表达的变化见图1-图2。小鼠哮喘模型组肺组织VEGF蛋白质印迹表达较正常对照组显著增加(P<0.01)。应用麻黄定喘汤低、高剂量干预后,肺组织VEGF蛋白质印迹表达均较哮喘模型组明显下降(P<0.05, P<0.01)。

  4. 肺组织的病理学改变 见图3。光镜下观察 HE染色结果显示,正常对照组小鼠支气管肺组织无 明显病理改变。哮喘模型组小鼠气道壁及气道平滑 肌明显增厚,黏膜下层增宽,支气管上皮损伤脱落、 黏膜上皮增生,管腔被黏液所堵塞支气管,血管和支 气管周围有大量炎性细胞浸润;各治疗组小鼠上述改变较哮喘组明显减轻。

  5. 免疫组织化学染色检测肺组织VEGF蛋白表达见图4。免疫组织化学染色结果显示正常对照组小鼠支气管VEGF蛋白呈淡棕黄色弱免疫反应表达。哮喘模型组小鼠气道平滑肌、嗜酸性粒细胞,杯状细胞VEGF蛋白呈强棕黄色强免疫反应表达,与正常对照组比较差异有显著性。与哮喘模型组相比较,各治疗组气道平滑肌、嗜酸性粒细胞, 杯状细胞VEGF蛋白表达明显减弱。

  讨论

  气道慢性炎症、气道高反应性、气道重塑[4]是哮喘的三大主要病理生理特征。其中哮喘发生主要原因是气道重塑。气道重塑是导致哮喘气道狭窄、呼吸困难以及迁延不愈的主要因素,也是临床治疗哮喘的主要难题 [5-7]。VEGF主要生物学功能有:增加血管的通透性、促进血管生成、改变细胞外基质、调节血管内皮细胞及肺泡上皮细胞的凋亡。有研究表明, VEGF在血管丰富的组织中广泛表达,在肺中表达尤为明显[8]。因此,VEGF在哮喘进展中发挥着重要作用[4]。其作用机制是与血管内皮受体特异性结合[9], 促进血管内皮细胞增殖,使得机体内微血管的通透性增加,促进血管生成,可以认为其与血管生成以及气道慢性炎症反应有关[10]。本研究还发现应用不同剂量的麻黄定喘汤干预后,VEGF的表达强弱不一样。同时,麻黄定喘汤干预后小鼠炎性细胞计数、IL-4、IFN-γ、VEGF的表达虽较哮喘模型组明显下降,但仍高于正常对照组,提示存在未被麻黄定喘汤作用的其它机制共同参与了哮喘病理生理过程。进一步探讨麻黄定喘汤作用机制对其临床应用具有重要意义。

  [参考文献]

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