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培哚普利对APPswe/PS1dE9双转基因痴呆模型小鼠认知功能的改善及脑中NOS的影响

发表日期:2020-01-10 10:11:43   编辑:张淑萍 张腾腾

  摘要 目的:探讨培哚普利对APPswe/PS1dE9双转基因痴呆模型小鼠认知功能的改善及脑中NO合酶的影响。方法:将APPswe/PS1dE9 四月龄双转基因雄性小鼠随机分为三组:即模型组、培哚普利治疗组、石杉碱甲治疗组。另外选择同等数量的四月龄野生雄性小鼠作为正常组。灌药两个月以后,观察小鼠一般状态,并采用Morris水迷宫对痴呆小鼠的学习记忆能力进行测试。测试结束后对各组小鼠海马的iNOS和nNOS含量进行测定。结果:与石杉碱甲治疗组相比,培哚普利治疗组能够明显改善APPswe/PS1dE9双转基因痴呆模型小鼠的认知功能,并且能够降低小鼠海马组织中iNOS、nNOS的含量。结论:培哚普利能够明显提高APPswe/PS1dE9双转基因痴呆模型小鼠的认知能力,同时降低小鼠海马组织中iNOS及nNOS的含量。

  关键词 阿尔兹海默病(AD);培哚普利;一氧化氮合酶

  阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)[1]是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变。临床上表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害、抽象思维和计算力损害、人格和行为改变等。培哚普利是ACEI类药物中的一种,除传统的血压调节、水盐代谢、垂体激素分泌等生理功能外,对于神经可塑性和学习记忆等认知功能也有重要作用[2,3],目前许多国内外学者研究表明其可以通过血脑屏障产生中枢性作用[4],本研究着重分析培哚普利对老年痴呆小鼠认知功能的改善及对小鼠海马区NOS(iNOS、nNOS)水平的影响,为今后老年痴呆的预防及治疗提供新思路。

  1实验材料与方法

  1.1 实验动物 选取四月龄APPswe/PS1dE9双转基因痴呆小鼠30只及四月龄野生雄性小鼠10只。APPswe/PS1dE9双转基因痴呆小鼠购自中国医学科学院神经科学研究所(该品系小鼠引种于美国JACKSON实验室),四月龄野生雄性小鼠由佳木斯大学动物中心提供,饲养于佳木斯大学生命科学实验中心。实验过程中动物自由摄食和饮水。动物饲养及所有实验操作均严格遵守佳木斯大学生命科学实验中心实验动物伦理委员会的相关规定进行。

  1.2 药品试剂与仪器 培哚普利片购自施维雅(天津)制药有限公司,石杉碱甲片购自上海复旦复华药业有限公司,iNOS、nNOS试剂盒购自上海沪震生物科技有限公司,标准型脑立体定位仪购自深圳市瑞沃德(RWD)生命科技有限公司。

  1.3 动物分组及模型 将四月龄APPswe/PS1dE9双转基因痴呆小鼠随机分为3组,即空白对照组(模型组)、培哚普利治疗组、石杉碱甲治疗组,另选择同等数量的野生四月龄雄性小鼠作为正常组。实验组每天灌胃培哚普利片混悬液1mg/( kg/d),阳性对照组每天灌胃石杉碱甲片 (该药为胆碱酯酶抑制剂 )混悬液 0.3mg /(kg/d)〔5〕,空白对照组及正常动物组给予等体积生理盐水灌胃。各组小鼠每日灌药 1次,连续 4个月。

  1.4 小鼠空间学习记忆能力测试Morris 水迷宫 各组小鼠在末次给药后次日进行 Morris 水迷宫测试小鼠的学习和记忆能力。恒温游泳池直径110cm,高50cm,水深为30cm,池壁周围涂上黑漆,将池壁分为四个象限,随机选取一个象限,在该象限的正中处放一个直径8cm,高度为20cm的白色小鼠站台,实验前使水温保持25 ℃,水内放入牛奶混匀。每次将小鼠分别从4个不同象限面壁入水,记录小鼠在60s内寻找平台的时间(逃避潜伏期)。若时间超过60s,则引导动物到平台并停留10s,此时潜伏期记为60s。以3个不同象限的平均值作为该次的逃避潜伏期,反映小鼠的空间学习能力。测试历时5d,每天训练一次。次日撤除原平台进行空间探索实验。随机选取一入水点将小鼠面壁入水,记录小鼠在60s内穿越原平台位置的次数,以及在原平台所在象限的停留时间,检测小鼠对原平台的空间记忆情况。测试过程中保持实验室内灯光、物品等空间参照物摆放位置不变,排除干扰因素。

  1.5 脑组织NOS含量测定 Morris 水迷宫测试后采用颈椎脱臼法将小鼠处死,将小鼠放置在标准型脑立体定位仪上,仔细分离出海马, 用预冷的 PBS(0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。

  1.6 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析实验各组数据,结果用均数±标准差(±s)表示,小鼠逃避潜伏期用重复测量方差分析,两组间差异采用LSD法进行组间差异显著性检验,P<0.05为差异有统计学意义。

  2.实验结果

  2.1 培哚普利对痴呆小鼠学习记忆的影响 见表1、表2。

  表1 各组小鼠逃避潜伏期的比较(±s)

  组别 动物数 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天

  正常组 10 17.56±0.64 15.87±0.71 14.60±0.91 13.83±0.71 12.69±0.81

  模型组 8 39.54±0.42** 37.04±0.79** 35.21±1.13** 33.39±0.70** 31.20±0.70**

  培哚普利组 8 23.45±0.71△△ 20.71±0.86△△ 18.63±0.95△△ 17.22±0.67△△ 14.99±0.74△△

  石杉碱甲组 8 35.59±0.65△ 33.19±0.43△ 31.19±0.58△ 29.11±0.87△ 27.25±0.35△

  注:与正常组相比,**P < 0.05,*P < 0.05;与模型组相比,△△P < 0. 01,△P < 0.05。

  从表1可知,与正常组比较,模型组各个时间点小鼠的逃避潜伏期的差异有统计学意义(p<0.1),并且随着时间的延长,各个组的潜伏期不断缩短,说明模型组小鼠学习记忆出现障碍。各治疗组与模型组比较,潜伏期均缩短,差异有统计学意义(p<0.01)。说明培哚普利组与石杉碱甲组均能使小鼠逃避潜伏期缩短,但二者效果相当,没有明显差别。

  表2 各组小鼠空间探索试验的原平台穿越次数和象限停留时间比较(±s)

  组别 动物数 原平台穿越次数 原平台象限停留时间(s)

  正常组 10 5.80±1.14 27.73±0.60

  模型组 8 1.50±0.76 17.95±1.02

  培哚普利组 8 4.13±0.83 25.31±0.64△△

  石杉碱甲组 8 2.50±0.93 19.05±0.57△

  注: 与正常组相比,**P < 0. 01,*P < 0. 05; 与模型组相比,△△P < 0. 01,△P < 0. 05。

  由表2可知,与正常对照组比较,模型组原平台象限停留时间及穿越次数明显减小,并且呈现显著性差异(p<0.01),表明双转基因痴呆小鼠学习记忆能力明显减退,表现为一定的痴呆症状。与模型组相比,石杉碱甲组与培哚普利组均有统计学意义,但培哚普利组小鼠原平台象限停留时间明显延长,原平台穿越次数明显增多,即培哚普利组效果更显著(p<0.01)。

  2.2 培哚普利对痴呆小鼠大脑海马内iNOS及nNOS的影响 见表3

  表3 各组小鼠大脑海马内iNOS及nNOS的含量(±s)

  组别 动物数 iNOS含量(u/mg) nNOS含量(u/mg)

  正常组 10 8.76±0.56 5.52±0.61

  模型组 8 14.43±0.42** 9.66±0.54**

  培哚普利组 8 10.30±0.53△△ 6.39±0.56△△

  石杉碱甲组 8 13.55±0.77△ 8.88±0.67△

  注: 与正常组相比,**P < 0. 01,*P < 0. 05; 与模型组相比,△△P < 0. 01,△P < 0. 05。

  从表3可知,模型组与正常组比较脑组织iNOS和nNOS含量均显著增加,说明痴呆小鼠脑组织中iNOS和nNOS表达水平升高,从而造成神经细胞死亡。与模型组相比,两治疗组中iNOS和nNOS含量均降低,但培哚普利组更明显(p<0.01),说明两组药均能减轻iNOS和nNOS对大脑的损害,但培哚普利效果更好。

  3 讨论

  肾素—血管紧张素系统(renin-aangiotensin-system,RAS)是人体内重要的体液调节系统。肾素作用于血管紧张素原,生成血管紧张素I(Ang I),Ang I在血管紧张素转换酶(ACE)的作用下,生成血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)。Ang Ⅱ有两个受体: 血管紧张素受体1( AT1R) 和血管紧张素受体2( AT2R) 。Ang Ⅱ主要作用于AT1R,可以导致血管收缩和内皮功能紊乱[6],并产生氧化应激而损害脑血管功能[7]。ACEI类药物主要抑制ACE,使Ang Ⅱ的生成减少,从而减轻其对脑组织和神经元的损害。有资料表明[8],能作用于中枢神经的血管紧张素转换酶抑制剂如卡托普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利、雷米普利等能通过血脑屏障,有效防止痴呆, 控制并减少氧化应激, 减轻脑内炎症。本文通过Morris 水迷宫实验,记录小鼠逃避潜伏期、小鼠空间探索试验的原平台穿越次数、象限停留时间。证实,在使用中枢性ACEI类药物培哚普利后,小鼠的学习记忆能力明显得到改善。

  一氧化氮(nitric oxide, NO)是体内重要的信使分子,NO 在体内由L- 精氨酸在一氧化氮合成酶(nitricoxide synthase,NOS)的催化作用下生成。NOS有三种亚型,即神经元型一氧化氮合成酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)[9]。其中,nNOS 和eNOS 在生理条件下可正常表达,而iNOS 在生理条件下不表达,只在病理条件下诱导表达,激活后会长时间大量合成NO。由于NO性质不稳定,实验条件下能检测到的含量极少,而NO的含量与NOS的活性呈正相关,固本实验对iNOS、nNOS的含量进行了检测,从而间接说明NO对小鼠认知功能的影响。

  本实验发现转基因痴呆小鼠大脑中iNOS 和nNOS均明显升高,表明炎症性刺激使诱导型NOS( iNOS)和神经元型NOS(nNOS)过度表达,使体内生成的NO增多,产生神经毒性[10];对其一般行为学观察发现,小鼠喜蜷卧,实验人员敲击鼠栅栏不予理睬,对气味及食物反应迟钝,并且在Morris 水迷宫试验中表现出逃避潜伏期明显延长,原平台穿越次数和原平台象限停留时间缩短。猜测其机制可能为nNOS及iNOS激活产生的NO,激活凋亡级联反应通向细胞死亡的最后共同通路,诱导细胞凋亡,从而使小鼠学习记忆功能出现障碍。而在使用培哚普利进行干预后,发现小鼠反应变得敏捷,一有动静即睁眼, 跑到栅栏张望, 对气味也比较敏感, 实验人员取带香味的食物置笼边, 小鼠立即跑来, 鼻腔作嗅物状。水迷宫实验结果也出现巨大反差,即小鼠平台逃避潜伏期缩短,原平台穿越次数和平台象限停留时间增多;同时发现痴呆小鼠脑中iNOS 和nNOS含量均显著降低,推断培哚普利能通过小鼠的血脑屏障,抑制血管紧张素转换酶的作用,使血管紧张素Ⅱ生成减少,使其对AT1R受体的作用减弱,增加脑血流灌注,有对抗氧化应激,保护脑血管功能,有利于神经细胞分化、再生和存活,诱导神经元分化以及轴突生长,有利于损伤神经的功能修复,从而改善认知功能。

  综上所述,培哚普利对APPswe/PS1dE9双转基因痴呆模型小鼠有显著的防治作用,能够抑制iNOS 和nNOS的合成,从而降低脑组织NO的产生,提高小鼠学习认识能力,从而为今后老年痴呆的预防提供新的思路。

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